Assemblaggio Gibson
L'assemblaggio Gibson® (in inglese Gibson assembly®) è un approccio di clonaggio che consente di unire tra loro vari frammenti di DNA in un'unica reazione isotermica. È stata creata da Daniel G. Gibson, Vice Presidente della DNA Technology al Synthetic Genomics Inc (SGI), in collaborazione con l'istituto J. Craig Venter (JCVI).[1]
Processo modifica
L'intera reazione dell'assemblaggio Gibson richiede pochi componenti con una quantità minima di manipolazioni da parte dell'operatore.[1][2]
Il metodo può simultaneamente combinare fino a 15 frammenti di DNA sulla base di una identità di sequenza. Richiede che i frammenti contengano una sovrapposizione di circa 20-40 basi rispetto al frammento adiacente. Questi frammenti vengono, dunque, miscelati assieme a tre enzimi e specifici componenti della soluzione tampone.
I tre enzimi richiesti sono: esonucleasi, DNA polimerasi e DNA ligasi.
- L'esonucleasi degrada il DNA dall'estremità 5', in maniera tale che l'attività polimerasica non sia interrotta e che il processo si concluda in un singolo step. Le regioni a singola elica prodotte possono legarsi ai frammenti di DNA adiacenti grazie alle porzioni sovrapposte.
- La DNA polimerasi incorpora i nucleotidi necessari a riempire le zone rimaste a singola elica.
- La DNA ligasi unisce covalentemente i frammenti di DNA adiacenti, rimuovendo qualsivoglia nick nella sequenza.
Il prodotto risultante è un'unica sequenza di DNA composta da più frammenti giustapposti tra loro. È possibile produrre sia DNA circolare sia lineare.
Esistono due diversi approcci per l'assemblaggio Gibson: ad uno step e a due step. Entrambi i metodi vengono eseguiti in un unico ambiente di reazione. Il metodo a singolo step consente l'assemblaggio di massimo 5 frammenti differenti in un unico processo isotermico. In questo metodo i frammenti sono miscelati ad un mix di enzimi commerciale e la soluzione viene, poi, incubata a 50 °C per massimo un'ora. Per la creazione di costrutti più complessi, in cui fino a 15 frammenti diversi possono essere ligati assieme o in cui i frammenti desiderati raggiungono fino a 10kb, è necessario avvalersi del metodo a due step. Esso richiede due diverse aggiunte del mix di enzimi commerciale, uno in cui è consentita l'attività esonucleasica e l'annealing dei segmenti sovrapponibili; il secondo per le fasi di polimerizzazione e ligazione. Per questo approccio i tempi e le temperature di incubazione possono variare.
Vantaggi modifica
Questo metodo di assemblaggio del DNA possiede numerosi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali di clonaggio del DNA ricombinante.
- Non è richiesta nessuna digestione dei frammenti di DNA con enzimi di restrizione dopo la PCR. Tuttavia, lo scheletro del vettore può essere digerito o sintetizzato tramite PCR.
- È più economico e veloce rispetto ai tradizionali schemi di clonaggio, infatti necessita un minor numero di fasi e reagenti.
- Non rimane alcuna traccia nei punti di ligazione tra i frammenti, anche se le regioni tra le doppie eliche e le estremità sospese sono leggermente suscettibili a mutazioni quando la DNA polimerasi chiude gli spazi vuoti.
- Fino a 5 frammenti possono essere combinati simultaneamente in un'unica reazione usando una miscela di enzimi standard.
- Fino a 15 frammenti possono essere legati simultaneamente usando una reazione a due step. I questo approccio la fase esonucleasica e di annealing sono eseguite per prime. In seguito si procede con l'addizione della DNA polimerasi e ligasi.
- L'assemblaggio Gibson è frequentemente adoperato per la mutagenesi sito-specifica per incorporare mutazioni quali inserzioni, delezioni e mutazioni del singolo nucleotide.
Note modifica
- ^ a b Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA 3rd, Smith HO, Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, in Nature Methods, vol. 6, n. 5, 2009, pp. 343–345, DOI:10.1038/nmeth.1318, PMID 19363495.
- ^ Gibson DG., Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments, in Methods in Enzymology, vol. 498, 2011, pp. 349–361, DOI:10.1016/B978-0-12-385120-8.00015-2, PMID 21601685.