Utente:Hazelmate/Sandbox

Fasi del clonaggio

Il processo del clonaggio richiede 4 fasi: isolamento di una sequenza di DNA, inserimento della sequenza in una cellula ospite, moltiplicazione delle cellule riceventi e selezione delle cellule.

Isolamento

Il clonaggio può essere effettuato su una sequenza di DNA del genoma o su una copia a DNA di un RNA messaggero (mRNA). Nel primo caso si possono prelevare anche sequenze non codificanti, mentre nel secondo si può isolare solo la sequenza espressa di un gene, metodo preferito nelle biotecnologie. Nel caso in cui si scelga una molecola di mRNA, per poterlo inserire nel genoma si utilizza un enzima, chiamato trascrittasi inversa, che permette di convertirlo nuovamente in DNA. La copia di una sequenza di mRNA è detta DNA complementare (cDNA), l'insieme di questi è chiamata libreria di cDNA. L'isolamento della sequenza di mRNA interessata avviene grazie alla sua caratteristica di avere una coda di poli-A all'estremità 3', formata da adenosina, l'RNA viene immerso in una resina contenente catene di poli-T che si legano alle code poli-A, il restante mRNA viene poi raccolto nella sua forma pura.

Inserimento

Per inserire le molecole selezionate di cDNA si utilizzano i vettori plasmidici. Per inserire nel vettore la sequenza scelta è necessario tagliare una sequenza di DNA plasmidico e sostituirla con quella selezionata. A questo punto bisogna utilizzare particolari enzimi batterici, endonucleasi di restrizione, capaci di legarsi a determinate sequenze di DNA e tagliare la doppia elica negli appositi siti di taglio, per preparare il cDNA e il vettore all'inserimento. L'inserimento vero e proprio avviene attraverso le DNA ligasi, enzimi che ripristinano il legame fosfodiesterico tra i nucleotidi, saldando due frammenti di DNA distinti.

Moltiplicazione

I DNA ricombinanti contenenti cDNA vengono inseriti nelle cellule batteriche ospiti. I vettori contengono anche un plasmide di resistenza a una particolare sostanza; Solo alcuni batteri, quelli che contengono il fattore di resistenza all'antibiotico in cui vengono fatti riprodurre, sopravvivono. Questi possiedono tutte le sequenze di cDNA. Ogni singola cellula originerà un clone di un singolo cDNA. L’insieme dei cloni è la biblioteca di DNA.

Selezione

Per capire in quali batteri è effettivamente presente la sequenza di cDNA si usa il metodo di Southern Blotting. Questo procedimento è composto da tre fasi:

• Elettroforesi sul gel di agarosio: i cDNA digeriti vengono inseriti in pozzetti formatosi dalla solidificazione di una miscela contenente agarosio. Applicando un campo elettrico, il DNA (carico negativamente) si sposta verso il polo positivo e le molecole si separano in base al peso molecolare. ll vettore più pesante andrà più lentamente del cDNA (più leggero).
• Trasferimento: la doppia elica del DNA viene aperta e viene appoggiato a una membrana di nitrocellulosa.
• Ibridazione: viene preparata in laboratorio una molecola di DNA complementare alla sequenza che contiene una molecola di fosforo radioattivo (32P), facilmente riconoscibile dalla fosforescenza. Il cDNA di interesse si lega spontaneamente alla molecola complementare, così da essere riconosciuto.