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Il materiale vegetale che ha subito il pre-trattamento viene ora trattato con spazzola, materiale quali carborundum e cutinasi allo scopo di aumentare la resa del trattamento enzimatico. Può rivelarsi anche utile incubare il materiale vegetale al buio, allo scopo di facilitare il distacco dell' epidermide inferiore, sul quale verrà svolto il trattamento enzimatico.
Terminate queste operazioni preliminari, si trasferisce quindi l'epidermide inferiore su un substrato
-pH del substrato leggermente sub-acido ( 5,5-6,0)
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