Protoplasto: differenze tra le versioni

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L'insieme dei protoplasmi di un organismo vegetale viene detto [[simplasto]].
 
La parola deriva da ''protoplasma'', termine con cui si indica la materia vivente.
L'isolamento di protoplasti può avvenire sia da cellule vegetali che da cellule microbiche. La [[penicillina]] converte i batteri gram positivi in protoplasti inibendo la sintesi del [[peptidoglicano]] presente nella loro parete.
 
==Pre-trattamento==
 
Si preleva del materiale vegetale (normalmente una foglia) e si prevede alla sua sterilizzazione. La foglia ora sterilizzata viene tagliata in fette o dischi molto sottili e si tratta tale materiale con una soluzione di saccarosio e sorbitolo al 20%. Tale soluzione richiama acqua dalla cellula che quindi si sgonfia poca alla volta. Il pre-trattamento ha lo scopo di aumentare la vitalità dei protoplasti e può essere svolta o prima o durante il trattamento enzimatico. In questo secondo caso la soluzione di saccarosio e sorbitolo verrà aggiunto al mix di enzimi.
Per aumentare la vitalità dei protoplasti è necessario partire da tessuti estremamente giovani caratterizzati da un'attiva divisione. A questo scopo sono molto tessuti che derivano da colture in vitro di germogli.
 
==Trattamento enzimatico==
 
Il materiale vegetale che ha subito il pre-trattamento viene ora trattato con spazzola, materiale quali carborundum e cutinasi allo scopo di aumentare la resa del trattamento enzimatico. Può rivelarsi anche utile incubare il materiale vegetale al buio, allo scopo di facilitare il distacco dell' epidermide inferiore, sul quale verrà svolto il trattamento enzimatico.
Terminate queste operazioni preliminari, si trasferisce quindi l'epidermide inferiore su un substrato contenente un mix di enzimi idrolitici ossia cellulasi, emicellulasi e pectinasi. Tali enzimi degraderanno la parete cellulare facendoci ottenere un protoplasto. Tale trattamento viene svolto nelle seguenti condizioni:
 
Si sfrutta la bassa densità per protoplasti per isolarli dal materiale inquinante. Si usano saccarosio e sorbitolo e si centrifuga il tutto ottenendo i protoplasti nella parte alta della provetta. Si possono anche creare gradienti continui o discontinui. In questo caso si usano sostanze ad alto peso molecolare come il polisaccaride [[Ficoll]]. In questo caso i protoplasti saranno posizionati tra il polisaccaride e la soluzione zuccherina
 
== Verifica dalle loro purezza, vitalità e dimensione ==
 
Una volta recuperati i protoplasti occorre valutare la loro purezza, ossia l'assenza di residui di parete cellulare. Per valutarne la purezza si utilizzano sostanze fluorescenti che evidenziano la presenza di cellulosa. Molto utilizzata è la molecola calcoflour white in concentrazione intorno all'1%.
Nelle monocotiledoni il diametro dei protoplasti è sempre inferiore a 30 micrometri, nei protoplasti che derivano da colture cellulare in sospensione il diametro è superiore ai 30 micrometri e infine quelli che derivano da foglie hanno diametro variabile dai 20 ai 40 micrometri
 
==Calcolo del numero di protoplasti isolati==
 
Il conteggio va fatto su almeno 500 protoplasti. Tale conteggio viene fatto usando ematocitometro. Una buona resa si ha quando il 50% dei protoplasti risulta vitale. Essa normalmente diminuisce durante i primi giorni di coltura
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