Differenze tra le versioni di "Protoplasto"

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{{S|citologia}}
[[File:Protoplasts Petunia sp.jpg|thumb|Protoplasti ottenuti da cellule di una foglia di petunia]]
Indica l'unità di [[protoplasma]] della cellula e consiste di [[citoplasma]] e [[nucleo cellulare|nucleo]]. Sostanzialmente è tutto il '''contenuto''' del ''lume cellulare'' e vi si comprende anche la [[membrana citoplasmatica]].<br />
Il lume cellulare indica lo ''spazio fisico'', il protoplasto indica il ''contenuto''. Il protoplasto è presente nelle cellule vive, ma non in quelle morte: in quest'ultimo caso il lume cellulare non conterrà protoplasto.<br />
L'insieme dei protoplasmi di un organismo vegetale viene detto [[simplasto]].
 
Per ottenere un protoplasto da una cellula vegetale si eseguono normalmente le seguente procedure:
 
-1) Pre-trattamento (induzione della plasmolisi)
 
-2) Trattamento enzimatico
 
-3) Recupero dei protoplasti
 
-4) Verifica dalle loro purezza, vitalità e dimensione
 
-5) Calcolo del numero di protoplasti isolati
 
==Pre-trattamento==
==Trattamento enzimatico==
 
Il materiale vegetale che ha subito il pre-trattamento viene ora trattato con spazzola, materiale quali carborundum e cutinasi allo scopo di aumentare la resa del trattamento enzimatico. Può rivelarsi anche utile incubare il materiale vegetale al buio, allo scopo di facilitare il distacco dell' epidermide inferiore, sul quale verrà svolto il trattamento enzimatico.
Terminate queste operazioni preliminari, si trasferisce quindi l'epidermide inferiore su un substrato contenente un mix di enzimi idrolitici ossia cellulasi, emicellulasi e pectinasi. Tali enzimi degraderanno la parete cellulare facendoci ottenere un protoplasto. Tale trattamento viene svolto nelle seguenti condizioni:
 
-pH del substrato leggermente sub-acido ( 5,5-6,0)
 
-alla luce o al buio
==Recupero dei protoplasti==
 
Terminata la digestione enzimatica si devono recuperare i protoplasti. Essi non saranno isolati, ma si troveranno in contatto con numeroso materiale inquinante ( resti della parete cellulari, organelli, corpi di riserva ecc.), per cui occorre precedere al loro isolamento.
Per isolarli vengono usate le seguenti procedure:
 
 
Una volta recuperati i protoplasti occorre valutare la loro purezza, ossia l'assenza di residui di parete cellulare. Per valutarne la purezza si utilizzano sostanze fluorescenti che evidenziano la presenza di cellulosa. Molto utilizzata è la molecola calcoflour white in concentrazione intorno all'1%.
Viene poi valutata la vitalità dei protoplasti usando opportune molecole fluorescenti che evidenzino in maniera inequivocabile i protoplasti vivi. Molto usata è FDA ( fluorescina diacetato), tale molecola entra nei protoplasti e qui viene idrolizzato a fluorescina, molecola fluorescente che viene trattenuta dalla membrana citoplasmatica dei soli protoplasti vivi.
Si valuta infine la dimensione dei protoplasti, in quanto dalla dimensione dipenderà la loro resistenza all' eletroporazione.
Nelle monocotiledoni il diametro dei protoplasti è sempre inferiore a 30 micrometri, nei protoplasti che derivano da colture cellulare in sospensione il diametro è superiore ai 30 micrometri e infine quelli che derivano da foglie hanno diametro variabile dai 20 ai 40 micrometri