Differenze tra le versioni di "Protoplasto"

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==Pre-trattamento==
 
Si preleva del materiale vegetale (normalmente una foglia) e si prevede alla sua sterilizzazione. La foglia ora sterilizzata viene tagliata in fette o dischi molto sottili e si tratta tale materiale con una soluzione di [[saccarosio]] e [[sorbitolo]] al 20%. Tale soluzione richiama acqua dalla cellula che quindi si sgonfia poca alla volta. Il pre-trattamento ha lo scopo di aumentare la vitalità dei protoplasti e può essere svolta o prima o durante il trattamento enzimatico. In questo secondo caso la soluzione di saccarosio e sorbitolo verrà aggiunto al mix di enzimi.
Per aumentare la vitalità dei protoplasti è necessario partire da tessuti estremamente giovani caratterizzati da un'attiva divisione. A questo scopo sono moltospesso usati tessuti che derivano da colture in vitro di germogli.
 
==Trattamento enzimatico==
 
Il materiale vegetale che ha subito il pre-trattamento viene ora trattato con spazzola, materiale quali [[Carburo di silicio|carborundum]] e cutinasi allo scopo di aumentare la resa del trattamento enzimatico. Può rivelarsi anche utile incubare il materiale vegetale al buio, allo scopo di facilitare il distacco dell'epidermide inferiore, sul quale verrà svolto il trattamento enzimatico.
Terminate queste operazioni preliminari, si trasferisce quindi l'epidermide inferiore su un substrato contenente un mix di enzimi idrolitici ossia [[cellulasi]], emicellulasi e pectinasi. Tali enzimi degraderanno la parete cellulare facendoci ottenere un protoplasto. Tale trattamento viene svolto nelle seguenti condizioni:
 
-[[pH]] del substrato leggermente sub-acido (5,5-6,0)
 
-alla luce o al buio
-Filtrazione
 
La filtrazione viene svolta usando dei filtri aventi porosità di 100 micrometri. Normalmente tale procedure non ha un'alta resa di purificazione, per cui il filtrato viene centrifugato. Da questa centrifugazione si ottiene un supernatante che viene eliminato e un pellet che viene lavato con una soluzione [[Pressione osmotica|ipotonica]] e risospeso.
 
-Flottazione
== Verifica dalle loro purezza, vitalità e dimensione ==
 
Una volta recuperati i protoplasti occorre valutare la loro purezza, ossia l'assenza di residui di parete cellulare. Per valutarne la purezza si utilizzano sostanze [[Fluorescenza|fluorescenti]] che evidenziano la presenza di cellulosa. Molto utilizzata è la molecola calcoflour white in concentrazione intorno all'1%.
Viene poi valutata la vitalità dei protoplasti usando opportune molecole fluorescenti che evidenzino in maniera inequivocabile i protoplasti vivi. Molto usata è FDA (fluorescina diacetato), tale molecola entra nei protoplasti e qui viene idrolizzato a [[fluorescina]], molecola fluorescente che viene trattenuta dalla membrana citoplasmatica dei soli protoplasti vivi.
Si valuta infine la dimensione dei protoplasti, in quanto dalla dimensione dipenderà la loro resistenza all'eletroporazione[[elettroporazione]].
Nelle [[Liliopsida|monocotiledoni]] il diametro dei protoplasti è sempre inferiore a 30 micrometri, nei protoplasti che derivano da colture cellulare in sospensione il diametro è superiore ai 30 micrometri e infine quelli che derivano da foglie hanno diametro variabile dai 20 ai 40 micrometri
 
==Calcolo del numero di protoplasti isolati==
 
Il conteggio va fatto su almeno 500 protoplasti. Tale conteggio viene fatto usando un ematocitometro. Una buona resa si ha quando il 50% dei protoplasti risulta vitale. Essa normalmente diminuisce durante i primi giorni di coltura
 
resa = n x V tot sosp x PF (tessuto di partenza)-1