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Struttura schematica di un amplicone

In biologia molecolare, un amplicone è un frammento di DNA o RNA che è la fonte e/o il prodotto di reazioni di amplificazione o di replicazione. Un amplicone può essere sintetizzato artificialmente, utilizzando vari metodi tra i quali le reazioni a catena della polimerasi (PCR), le reazioni a catena della ligasi (LCR) oppure sintetizzato naturalmente attraverso la replicazione genica. In questo contesto, l'amplificazione si riferisce alla produzione di una o più copie di un frammento genetico o sequenza bersaglio, in particolare l'amplicone. Poiché si riferisce al prodotto di una reazione di amplificazione, l'amplicone è usato in modo intercambiabile con termini di laboratorio comuni, come "prodotto di PCR" o "sequenza target".

L'amplificazione artificiale è utilizzata nella ricerca,[1] nelle scienze forensi,[2] in medicina,[1] per scopi che includono il rilevamento e la quantificazione di agenti infettivi,[3] l'identificazione di resti umani,[4] e l'estrazione di materiale genetico da capelli o peli umani.[2]

La duplicazione genica naturale gioca un ruolo importante nell'evoluzione. È implicata anche in diverse forme di cancro umano tra cui il linfoma primitivo delle cellule B del mediastino e il linfoma di Hodgkin.[5] In questo contesto il termine amplicone può riferirsi sia a una sezione di DNA cromosomico che è stata asportata, amplificata e reinserita altrove nel genoma, sia a un frammento di DNA extracromosomiale noto come double minute, ciascuno dei quali può essere composto da uno o più geni. L'amplificazione dei geni codificati da questi ampliconi generalmente aumenta la trascrizione di quei geni e, di conseguenza, il volume delle proteine per le quali codificano.[6]

StrutturaModifica

Gli ampliconi, in generale, sono sequenze genetiche di ripetizioni dirette (testa-coda, es. 5´ TTACGnnnnnnTTACG 3´ o 3´ AATGCnnnnnnAATGC 5´) oppure di ripetizioni inverse (testa-testa o coda-coda, es. 5'---TTACGnnnnnnCGTAA---3') e possono avere struttura lineare o circolare.[7] Gli ampliconi circolari consistono in duplicazioni invertite imperfette, ricomposte in un cerchio[8] e si pensa che originino da ampliconi lineari.[9] Durante l'amplificazione artificiale, la lunghezza finale dell'amplicone (espressa in numero di basi) è dettata dagli obiettivi sperimentali.[10]

TecnologiaModifica

L'analisi degli ampliconi è stata resa possibile grazie allo sviluppo di metodi di amplificazione come la PCR, e da un numero sempre maggiore di tecnologie più economiche e ad alto rendimento fra cui:

Le tecnologie di sequenziamento del DNA come il next generation sequencing, hanno permesso di studiare gli ampliconi nell'ambito della biologia del genoma e nella genetica del genoma, compresa la ricerca sulla genetica del cancro, la ricerca filogenetica e la genetica umana.[13]

Indipendentemente dall'approccio scelto per la sintesi degli ampliconi, è necessario utilizzare alcune tecniche per quantificare il prodotto.[14] Generalmente, queste tecniche includono una fase di acquisizione e una fase di rilevamento, sebbene il modo in cui tali passaggi sono incorporati è dipendente dal singolo dosaggio. Alcuni esempi possono essere:

  • il test Amplicor HIV-1 Monitor (RT-PCR), che ha la capacità di riconoscere l'HIV nel plasma;
  • l'HIV-1 QT (NASBA), che viene utilizzato per misurare la carica virale plasmatica, amplificando un segmento dell'RNA dell'HIV;
  • la Transcription Mediated Amplification, che impiega un test di protezione all'ibridazione per distinguere le infezioni da Chlamydia trachomatis.[14]

In ciascuno degli approcci di cui sopra, sono coinvolte diverse fasi di rilevamento e acquisizione per valutare il prodotto di amplificazione o amplicone.

  1. ^ a b Meyers, Robert A. (Robert Allen), 1936-, Molecular biology and biotechnology : a comprehensive desk reference, VCH, 1995, ISBN 1560815698, OCLC 32468573.
  2. ^ a b P. S. Walsh, D. A. Metzger e R. Higuchi, Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material, in BioTechniques, vol. 10, nº 4, April 1991, pp. 506–513. URL consultato il 4 maggio 2018.
  3. ^ (EN) Center for Biologics Evaluation and Research, Premarket Approvals (PMAs) - Roche Amplicor HIV-1 Monitor Test, su www.fda.gov. URL consultato il 4 maggio 2018.
  4. ^ P. Gill, P. L. Ivanov e C. Kimpton, Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis, in Nature Genetics, vol. 6, nº 2, February 1994, pp. 130–135, DOI:10.1038/ng0294-130. URL consultato il 4 maggio 2018.
  5. ^ Lixin Rui, N. C. Tolga Emre e Michael J. Kruhlak, Cooperative epigenetic modulation by cancer amplicon genes, in Cancer Cell, vol. 18, nº 6, 14 dicembre 2010, pp. 590–605, DOI:10.1016/j.ccr.2010.11.013. URL consultato il 4 maggio 2018.
  6. ^ Graham R. Bignell, Thomas Santarius e Jessica C. M. Pole, Architectures of somatic genomic rearrangement in human cancer amplicons at sequence-level resolution, in Genome Research, vol. 17, nº 9, September 2007, pp. 1296–1303, DOI:10.1101/gr.6522707. URL consultato il 4 maggio 2018.
  7. ^ Cohn, Waldo E. e Moldave, Kivie, 1923-, Progress in nucleic acid research and molecular biology. Volume 54, Academic Press, 1996, ISBN 9780080863429, OCLC 263084373.
  8. ^ K. Grondin, G. Roy e M. Ouellette, Formation of extrachromosomal circular amplicons with direct or inverted duplications in drug-resistant Leishmania tarentolae, in Molecular and Cellular Biology, vol. 16, nº 7, July 1996, pp. 3587–3595. URL consultato il 4 maggio 2018.
  9. ^ K. Grondin, C. Kündig e G. Roy, Linear amplicons as precursors of amplified circles in methotrexate-resistant Leishmania tarentolae, in Nucleic Acids Research, vol. 26, nº 14, 15 luglio 1998, pp. 3372–3378. URL consultato il 4 maggio 2018.
  10. ^ Primer Design Guide for PCR :: Learn Designing Primers for PCR, su www.premierbiosoft.com. URL consultato il 4 maggio 2018.
  11. ^ (EN) Bio-IT World, su www.bio-itworld.com. URL consultato il 4 maggio 2018.
  12. ^ (EN) DNA Electronics Licenses IP to Ion Torrent, in GenomeWeb. URL consultato il 4 maggio 2018.
  13. ^ (EN) Homepage, su National Human Genome Research Institute (NHGRI). URL consultato il 4 maggio 2018.
  14. ^ a b Stanley, Jacqueline., Essentials of immunology & serology, Delmar Thomson Learning, 2002, ISBN 9780766810648, OCLC 50204319.