Primer: differenze tra le versioni
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#Uno dei parametri più importanti è la temperatura di [[melting]] del primer, la temperatura alla quale il 50% delle molecole si trova in forma di doppia elica stabile ed il restante 50% in forma di singola elica. Tale temperatura è strettamente correlata al contenuto nucleotidico in AT (o in CG). Nella costruzione dei primer è necessario che i primer presentino una temperatura di melting e di annealing molto vicine (solitamente le differenze massime si possono attestare intorno a 1-2[[°C]]).
#I primers che funzionano maggiormente sono di solito quelli più ricchi di [[citosina|C]] o [[guanina|G]] alle estremità, perché sono quelli che si legano più fortemente al DNA stampo (instaurando tre [[legami idrogeno]] invece di due).
#La lunghezza dei primer è direttamente proporzionale alla temperatura di melting. Primer troppo corti sono spesso poco specifici; d'altra parte primer con temperature di melting troppo alte possono creare problemi alla DNA polimerasi, che è meno attiva a temperature superiori a 80 °C. La lunghezza ottimale di un primer è generalmente compresa tra 20 e 30 nucleotidi, con temperature di melting comprese tra 55 e 65 °C.
#Le sequenze dei primer devono essere scelte in modo tale che l'annealing avvenga solo con le sequenze d'interesse del DNA stampo, evitanto l'adesione a sequenze simili, con la conseguente perdita di specificità. Viene inoltre evitata la presenza di nucleotidi ripetuti o sequenze complementari all'interno dello stesso primer, per evitare la formazione di [[loop]], o forcine. Anche l'ibridizzazione tra primer diversi, per la presenza di sequenze ripetute e invertite, con formazione di dimeri, determina una diminuzione dell'efficienza dell'annealing.
#A volte si possono utilizzare ''primer degenerati'', costituiti da miscele di molecole simili ma non identiche (differenti per alcuni nucleotidi all'interno della sequenza). Primer degenerati risultano utili, ad esempio, quando si devono amplificare gli stessi geni provenienti da organismi diversi (che hanno sequenze simili ma non identiche), oppure quando la sequenza del gene è stata ricavata dalla sequenza della proteina corrispondente, tenendo conto della degenerazione del codice genetico. Un altro uso di primer degenerati è quello relativo al campo dell'[[ecologia]] microbica, per permettere l'amplificazione di geni di microrganismi di cui non è ancora nota l'informazione genomica.
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