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Colorazione di Gram: differenze tra le versioni

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==Procedura==
1. Mettere una goccia di acqua sul vetrino portaoggetti.
* Si pone nella piastra di coltura un [[colorante]] [[Base (chimica)|basico]] ([[Idrofilia|idrofilo]]) (tra i più usati anche [[violetto di genziana]] chiamato anche [[cristalvioletto]] o violetto di nicolle).
 
* Passati tre minuti, si opera un lavaggio con [[Reattivo di Lugol|liquido di Lugol]] (una soluzione di [[iodio]] e [[ioduro di potassio]] denominata mordenzante perché fissa la prima colorazione), che reagisce con il colorante basico formando un composto [[liposolubile]], e si lascia agire per circa un minuto.
2. Sterilizzare l'ansa e con essa prelevare il microrganismo da una piastra .
* Il preparato va poi trattato con decolorante (alcol o acetone) solo per una ventina di secondi (così agisce solo sui Gram− senza alterare anche i Gram+).
 
* Poi si aggiunge un secondo colorante ([[fucsina]] o safranina) che dona un colore rosato alle cellule che non hanno fissato il primo colorante viola.
3. Stendere il microrganismo prelevato dalla colonia sulla goccia.
A questo punto:
 
* i batteri Gram+ avranno trattenuto il colorante basico (viola), poiché l'alcol non ha danneggiato a sufficienza la spessa parete cellulare (idrofila) che non permette al colorante (idrofobo) di uscire.
4. Aspettare che si asciughi .
* i Gram- invece sono di colore rosato perché l'alcol ha sciolto i [[lipidi]] della membrana esterna danneggiando la sottile parete cellulare che non è più in grado di trattenere il complesso (effetto del mordenzante) cristal violetto-ioduro (liposolubile-idrofobo).
 
Risultato: i batteri Gram+ hanno colore violetto, mentre i Gram− hanno color rosso o rosa, o alcune volte giallastro.
5. Fissare sul vetrino passandolo sul bunsen in modo che aderisca per bene.
 
6. Predisporre una vaschetta per colorazione e appoggiare i vetrini su un supporto orizzontale oppure mantenere orizzontale il vetrino portaoggetti con l’aiuto di una pinza porta vetrini.
 
7. Ricoprire il preparato con cristal-violetto che colora le componenti acide (cioè il DNA) e lasciar agire per un minuto.
 
8. Versare l'eccesso di colorante e sciacquare con acqua; a questo punto i batteri Gram- veranno decolorate, mentre i Gram+ resistono all'azione del solvente e rimangono viola.
 
9. Ricoprire con il liquido di Lugol che funge da mordenzante. Lasciar agire per un minuto. Far scivolare l'eccesso di Lugol lavando con etanolo e decolorare per un tempo variabile tra 30 e 60 secondi, fino a che il preparato non lascia più il colore.
 
10. Contrastare con safranina per un minuto. Questo colora le componenti acide rimaste libere dei Gram- e li colora in rosso, mentre non puo' legarsi ai componenti molecolari dei Gram+, impegnati nel legame con il cristal-violetto. Sciacquare con acqua, sgocciolare il vetrino e lasciarlo asciugare all'aria o passandolo sul bunsen.
 
11. Osserva al microscopio ottico dapprima a basso ingrandimento e poi con obiettivo a immersione. Come risultato finale si avrà i batteri Gram+ di colore viola, mentre i batteri Gram- di colore rosso.
 
 
Le colture batteriche molto vecchie tendono a trattenere meno il colorante, apparendo meno Gram-positive di quanto siano in realtà; alcune (poche) specie di batteri inoltre non danno un responso chiaro alla colorazione, e sono dette ''Gram-variabili''.
Estratto da "https://it.wikipedia.org/wiki/Colorazione_di_Gram"