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Motivo adiacente al Protospacer

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Il Motivo adiacente al Protospacer (Protospacer adjacent motif, in sigla PAM) è una sequenza di 2-6 paia di basi immediatamente successiva alla sequenza di DNA identificata dalla nucleasi Cas9 nel sistema immunitario adattativo dei batteri mediato dal sistema CRISPR.[1]

PAM è il componente genico del plasmide o virus invadente, ma non è un componente del locus CRISPR del batterio. Se non seguita da nessuna sequenza PAM infatti, la sequenza di DNA da clivare/modificare non sarà né legata né riconosciuta da Cas9.[2][3][4][5]

PAM è un bersaglio essenziale che permette di distinguere il DNA-self dei batteri quello non-self. È infatti assente nei genomi batterici e ciò previene che la nucleasi Cas riconosca e distrugga il locus CRISPR.[6]

Spacers/protospacers modifica

I loci CRISPR di un batterio contengono degli "spacers", ovvero dei DNA virali inseriti in un locus CRISPR durante un'infezione pregressa. Nei sistemi immunitari adattativi CRISPR essi sono stati creati a partire dal protospacer, ovvero da DNA del virus o del plasmide invadente.

Pertanto il protospacer è riconosciuto come non-self, mentre lo spacer è riconosciuto come self grazie all'assenza delle PAM.

In seguito ad un'invasione, la nucleasi Cas9 si lega al tracrRNA:crRNA che a sua volta guida la proteina verso la sequenza protospacer del non-self virale.

Ma Cas9 non taglierà la sequenza protospacer a meno della presenza di una sequenza PAM ad essa adiacente.

Gli spacer nei loci CRISPR dei batteri non contengono alcuna sequenza PAM e pertanto non verranno processati dalla nucleasi.

Al contrario, i protospacer dei virus/plasmidi conterranno la sequenza PAM e quindi verranno clivati dalla nucleasi Cas9.

Per l'editing genetico come sostituto del complesso trascrRNA:crRNA si sintetizzano dei gRNAs (guideRNA, RNA Guida) che assolvono alla funzione di riconoscimento delle sequenze geniche precedenti una sequenza PAM all'estremità 3'.[7][8]

Sequenze PAM modifica

La PAM canonica è la sequenza 5'-NGG-3' dove "N" è qualsiasi nucleobase seguita da due nucleobasi contenenti guanina("G").[9]

Gli RNA-Guida (gRNAs) possono trasportare ovunque Cas9 per editare il genoma, a patto che la sequenza da clivare sia vicina ad una PAM.

La PAM canonica è associata alla nucleasi Cas9 dello Streptococcus pyogenes (designato col termine SpCas9); altre PAMs sono associate ad altre proteine Cas9 dei batteri: Neisseria meningitidis, Treponema denticola, e Streptococcus thermophilus.[10]

La sequenza 5'-NGA-3' può essere un'efficientissima PAM non canonica per le cellule umane, anche se la sua efficienza varia in base alla locazione all'interno del genoma.[11] Sono stati effettuati esperimenti per ingegnerizzare una Cas9 in grado di riconoscere diverse PAMs: questo per aumentare le potenzialità del sistema CRISPR-Cas9 permettendogli di editare geni in qualsiasi posizione all'interno del genoma.[12]

Cas9 di Francisella novicida riconosce la sequenza canonica PAM 5'-NGG-3', ma è stata ingegnerizzata per riconoscere anche la PAM 5'-YG-3' (dove "Y" è una pirimidina[13]), pertanto ampliando lo spettro di riconoscimento dei bersagli di Cas9.La nucleasi Cpf1 di Francisella novicida riconosce la PAM 5'-TTTN-3'[14] o la PAM 5'-YTN-3'.[15]

Oltre al sistema CRISPR-Cas9 e CRISPR-Cpf1 vi sono senza dubbio altre nucleasi e PAMs ancora da scoprire.[16]

Ad esempio il sistema CRISPR/C2c2 del batterio Leptotrichia shahii è CRISPR guidato da RNA che etichetta altro RNA piuttosto che DNA. Le PAM non sono fondamentali per un CRISPR che riconosce RNA; tuttavia l'efficacia del suo clivaggio è modulata da un omologo funzionale: una guanina che costeggia la sequenza da clivare, denominata in questo caso PFS (Protospacer Flanking Site).[17]

GUIDE-Seq modifica

Una tecnologia denominata GUIDE-Seq è stata escogitata per testare i clivaggi off-target prodotti dalla tecnica CRISPR-Cas9.[18] La necessità di avere una PAM può essere utile per etichettare mutazioni eterozigoti a singolo nucleotide senza provocare alcun effetto aberrante sugli alleli wild-type.[19]

Note modifica

  1. ^ Shah SA, Erdmann S, Mojica FJ, Garrett RA, Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity, in RNA Biology, vol. 10, n. 5, 2013, pp. 891–899, DOI:10.4161/rna.23764, PMC 3737346, PMID 23403393.
  2. ^ Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Almendros C, Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system, in Microbiology, vol. 155, Pt 3, 2009, pp. 733–740, DOI:10.1099/mic.0.023960-0, PMID 19246744.
  3. ^ Shah SA, Erdmann S, Mojica FJ, Garrett RA, Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity, in RNA Biology, vol. 10, n. 5, 2013, pp. 891–899, DOI:10.4161/rna.23764, PMC 3737346, PMID 23403393 (archiviato dall'url originale il 4 settembre 2014).
  4. ^ Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E, A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity, in Science, vol. 337, n. 6096, 2012, pp. 816–821, DOI:10.1126/science.1225829, PMID 22745249.
  5. ^ Sternberg SH, Redding S, Jinek M, Greene EC, Doudna JA, DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9, in Nature, vol. 507, n. 7490, 2014, pp. 62–67, DOI:10.1038/nature13011, PMC 4106473, PMID 24476820.
  6. ^ Mali P, Esvelt KM, Church GM, Cas9 as a versatile tool for engineering biology, in Nature Methods, vol. 10, n. 10, 2013, pp. 957–963, DOI:10.1038/nmeth.2649, PMC 4051438, PMID 24076990.
  7. ^ RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9 | Science, vol. 339, DOI:10.1126/science.1232033, PMID 23287722.
  8. ^ Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems | Science, vol. 339, DOI:10.1126/science.1231143, PMID 23287718.
  9. ^ vol. 513, DOI:10.1038/nature13579, PMID 25079318, https://oadoi.org/10.1038/nature13579.
  10. ^ vol. 10, DOI:10.1038/nmeth.2681, PMID 24076762, https://oadoi.org/10.1038/nmeth.2681.
  11. ^ vol. 4, DOI:10.1038/srep05405, PMID 24956376, https://oadoi.org/10.1038/srep05405.
  12. ^ vol. 523, DOI:10.1038/nature14592, PMID 26098369, https://oadoi.org/10.1038/nature14592.
  13. ^ Codes and Abbreviations, su genome.jp.
  14. ^ vol. 163, DOI:10.1016/j.cell.2015.09.038, PMID 26422227, https://oadoi.org/10.1016/j.cell.2015.09.038.
  15. ^ vol. 532, DOI:10.1038/nature17945, PMID 27096362, https://oadoi.org/10.1038/nature17945.
  16. ^ Even CRISPR, in The Economist, ISSN 0013-0613 (WC · ACNP). URL consultato il 27 maggio 2016.
  17. ^ DOI:10.1126/science.aaf5573, PMID 27256883, https://oadoi.org/10.1126/science.aaf5573.
  18. ^ vol. 33, DOI:10.1038/nbt.3117, PMID 25513782, https://oadoi.org/10.1038/nbt.3117.
  19. ^ vol. 11, DOI:10.1371/journal.pone.0144970, PMID 26788852, https://web.archive.org/web/20160314214433/http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371%2Fjournal.pone.0144970%2F (archiviato dall'url originale il 14 marzo 2016).

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