Polylinker

Regione plasmidica

Il polylinker o multiple cloning site (MCS) è una regione del plasmide nella quale può essere inserito un DNA esterno (10-11Kb). Molto utile in esperimenti di biologia molecolare. Questo DNA può essere inserito grazie all'aiuto di enzimi particolari, detti enzimi di restrizione. Questi enzimi agiscono a livello di una sequenza specifica, detta sito di restrizione, riconoscendola e applicando un taglio al filamento di DNA, generando o estremità appiccicose (sticky ends) o estremità nette (blunt ends). All'interno del MCS ci sono siti per circa 21 enzimi di restrizione.

I polylinkers trovano applicazione nelle tecniche del DNA ricombinante. In particolare, vengono utilizzati al fine di inserire un cDNA (DNA copiato da mRNA) all'interno del vettore (es plasmide). La tecnica prevede i seguenti step:

  1. ) Aggiunta dei polylinkers ad entrambe le estremità del cDNA, in presenza di ligasi (non ligasi eucariotica poiché non è in grado di saldare doppie eliche, ma solo singoli filamenti; si utilizza ligasi del fago T4 che invece riforma il legame fosfodiesterico a livello di doppia elica)
  2. ) Utilizzo un enzima di restrizione per la sequenza di interesse contenuta nei polylinkers, oltre che nel vettore. Ottengo in questo modo estremità appiccicose, sticky ends.
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