Northern blot: differenze tra le versioni

Il nome è derivato dalla tecnica analoga per il [[DNA]] ([[Southern blot]]).

 

L'[[RNA]] viene riscaldato a ca. 70°C per 3-5 minuti, poi viene raffreddato rapidamente in un bagno di ghiaccio fondente. Una piccola quantità di un agente denaturante viene aggiunta (solitamente [[formammide]]) per mantenere l'[[RNA]] privo di strutture secondarie.

 

L'[[elettroforesi]] permette di frazionare l'[[RNA]] in base al peso molecolare, e quindi in base alla lunghezza. Viene effettuata di solito su gel di agarosio in presenza di agenti denaturanti.

Per visualizzare l'RNA durante l'elettroforesi, si può utilizzare l'[[Intercalanti|etidio bromuro]], che si lega debolmente all'[[RNA]] ed emette luce fluorescente quando esposto a [[Radiazione ultravioletta|luce ultravioletta]].

 

L'[[RNA]] può essere trasferito su una membrana di nylon utilizzando il fenomeno della [[capillarità]]. Il gel viene preparato e incubato in una soluzione salina. La membrana viene poggiata al di sopra del gel ed una pila di carta assorbente viene posta al di sopra della membrana. Il movimento dell'acqua e degli ioni causa il trasferimento dell'[[RNA]] dal gel alla membrana, alla quale si lega mediante legami deboli. Per stabilizzare questi legami, il complesso membrana/[[RNA]] è sottoposto a crosslinking usando [[Radiazione ultravioletta|raggi ultravioletti]].

 

Per identificare l'[[RNA]] in oggetto di studio si possono utilizzare diverse metodologie, ma la più diffusa prevede l'utilizzo di una sonda di [[DNA]], cioè una sequenza di [[DNA complementare]] all'[[RNA]] (da cui la definizione di ''ibridizzazione'' o ''ibridazione'').

La sonda è spesso marcata con un [[isotopo]] [[Radioattività|radioattivo]] (ad esempio [[fosforo|³²P]]) oppure con una molecola facilmente individuabile con altre tecniche, ad esempio la [[digossigenina]].

 

Questa dipende dal tipo di marcatura utilizzato durante l'ibridazione. Nel caso di un [[isotopo ]][[Radioattività|radioattivo]], è possibile rilevare la posizione dell'[[RNA]] (legato adesso alla sonda marcata) esponendo la membrana ad una lastra fotografica.

 

[[de:Northern Blot]]