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Beta-glucuronidasi

Enzimi che catalizzano l'acido β-D-glucuronico dai mucopolisaccaridi
Le informazioni riportate non sono consigli medici e potrebbero non essere accurate. I contenuti hanno solo fine illustrativo e non sostituiscono il parere medico: leggi le avvertenze.

Le beta-glucuronidasi sono enzimi membri della famiglia delle glicosidasi che catalizzano la trasformazione dei carboidrati complessi.[2] La β-glucuronidasi umana è un tipo di glucuronidasi (un membro della famiglia glicosidasi che catalizza l'idrolisi dei residui di acido β-D-glucuronico dall'estremità non riducente dei mucopolisaccaridi (chiamati anche glicosaminoglicani) come ad esempio l'eparan solfato.[2][3][4] La β-glucuronidasi umana si trova nel lisosoma.[5][6] Nell'orletto a spazzola dell'intestino l'enzima converte la bilirubina coniugata nella forma non coniugata per il riassorbimento. La β-glucuronidasi è presente anche nel latte materno e contribuisce al manifestarsi dell'ittero neonatale.

Beta-glucuronidasi
Modello tridimensionale dell'enzima
Omotetramero di glucuronidasi
(ritenuto l'unità biologica)[1]
Numero EC3.2.1.31
ClasseIdrolasi
Banche datiBRENDA, EXPASY, GTD, PDB (RCSB PDB PDBe PDBj PDBsum)
Fonte: IUBMB
Beta-glucuronidasi
L'unità asimmetrica di β-glucuronidasi che mostra il sito attivo con residui Glu451, Tyr504, e Glu540, insieme con il residuo potenzialmente di supporto Asn450[1]
Gene
HUGOGUSB 4696
Entrez2990
LocusChr. 7 q11.21
Proteina
OMIM611499
UniProtP08236
Enzima
Numero EC3.2.1.31

Struttura modifica

La β-glucuronidasi umana è sintetizzata come un monomero di 80 kDa (653 amminoacidi) prima che una proteolisi rimuova 18 amminoacidi dall'estremità C-terminale per formare un monomero di 78 kDa.[7][8] La β-glucuronidasi esiste come un omotetramero di 332 kDa.[9] La β-glucuronidasi umana contiene diverse formazioni strutturali importanti, tra cui un tipo di barile (β-barrel) noto come barile "jelly roll" ed un barile TIM.

Prodotta dai lisosomi di qualsiasi cellula, si trova in alte concentrazioni nelle zone necrotiche di tumori estesi[10][11][12][13], caratterizzate all'esame chimico-istologico da variazioni dei normali livelli anche di altri enzimi (fosfatasi, esterasi non specifiche)[14]. È utilizzata per modificare l'assorbimento e l'azione locale e sistemica di farmaci a base di glucoronide, tra i quali agenti anticancro[15][16].
Studi più estesi sul collegamento, ad oggi non ancora chiarito, e rilevabile all'esame chimico-istologico fra alcuni enzimi e alcuni tipi di tumore, furono condotti da: Barry Goldin negli anni 1980 per gli enzimi beta-glucuronidase, nitroreduttasi, azoreduttsasi, e lo steroide 7-alpha-deidroxilasi; e dal Dr. Gunnar Johansson negli anni 1990 sugli stessi enzimi, cui aggiunse beta-glucosidasi e la sulfatasi.

Meccanismi di catalisi modifica

La β-glucuronidasi umana è omologa all'enzima β-galattosidasi di Escherichia coli.[17][18] Questa relazione omologa, insieme con la conoscenza che le glicosidasi eseguono spesso un'idrolisi catalizzata da due residui acidi, ha permesso lo sviluppo di una ipotesi meccanicistica. Secondo questa ipotesi i due residui di acido glutammico Glu540 e Glu451 sono i residui nucleofili e acidi, rispettivamente, e il residuo di tirosina Tyr504 verrebbe anch'esso coinvolto nella catalisi.
A sostegno di questa ipotesi, mutazioni indotte sperimentalmente su uno qualsiasi di questi tre residui comportano importante diminuzione dell'attività enzimatica. Al contrario l'aumento dell'attività di un enzima mutante E451A (dove Glu451 viene sostituito con un residuo di alanina) dopo l'aggiunta di azide è coerente con il fatto che Glu451 rappresenta il residuo acido/base.[19] Ulteriori studi eseguiti ricorrendo all'analisi di peptidi marcati di β-glucuronidasi, dopo idrolisi di un substrato che entra in una fase intermedia molto stabile, hanno permesso ai ricercatori di determinare che Glu540 è il residuo nucleofilo.[20]

Anche se il particolare tipo di sostituzione nucleofila impiegato dalla β-glucuronidasi non è ancora chiaro, evidenze inerenti ai meccanismi utilizzati dai loro omologhi della famiglia delle glicosidasi suggeriscono che queste reazioni siano qualitativamente reazioni SN2.
Le reazioni procedono attraverso uno stato di transizione con caratteristici carbocationi. Inizialmente, questi meccanismi, a causa di questo carbocatione caratteristico dello stato di transizione, si pensava fossero reazioni SN1 che procedevano attraverso un discreto "ione carbonio" intermedio. Tuttavia, evidenze più recenti suggeriscono che questi stati di carbocatione abbiano una durata variabile dai 10 femtosecondi agli 0.1 nanosecondi (simile a quella di un periodo di vibrazione di legame). Queste vite sono temporalmente troppo brevi per dare luogo a un intermedio di reazione. Ne consegue, da questa evidenze, che queste reazioni, pur avendo un aspetto SN1 causa della presenza caratteristica del carbocatione dei loro stati di transizione, debbano essere qualitativamente reazioni SN2.[2]

L'attività specifica di Tyr504 nel meccanismo catalitico è invece chiara. Raffrontando i dati strutturali dell'enzima omologo xilanasi, è stato suggerito che Tyr504 della β-glucuronidasi potrebbe stabilizzare il nucleofilo (Glu540) o modularne l'attività.[21]

In aggiunta a questi residui, un residuo conservato di asparagina (denominato Asn450) è stato suggerito che eserciti un'azione di stabilizzazione del substrato grazie alla presenza di un legame idrogeno al gruppo 2-idrossilico del substrato zucchero.[9][22]

Sindrome di Sly modifica

  Lo stesso argomento in dettaglio: Sindrome di Sly.

La carenza di β-glucuronidasi comporta la malattia metabolica ereditaria, non recessiva, nota come sindrome di Sly o Mucopolisaccaridosi VII. Una carenza di questo enzima provoca l'accumulo di mucopolisaccaridi non idrolizzati nell'organismo del paziente. Questa malattia può essere estremamente debilitante per il paziente o può causare idrope fetale prima della nascita. Nei pazienti che sopravvivono è possibile osservare ritardo mentale, bassa statura, caratteristiche facciali grossolane, anormalità spinali, epatomegalia e splenomegalia.[5] Questa malattia è stata riscontrata anche in un ceppo di topi così come in una famiglia di cani.[23][24] Più recentemente i ricercatori hanno scoperto una famiglia felina che presenta anch'essa carenze dell'attività β-glucuronidasi.
La fonte di questa riduzione di attività è stata identificata come una mutazione E351K (Glu351 è mutato ad un residuo di lisina). Glu351 è conservata nei mammiferi, la qual cosa suggerisce una funzione importante per questo residuo. Un esame a raggi X della struttura cristallina umana suggerisce che questo residuo (Glu352 nell'enzima umano), che è sepolto in profondità all'interno del dominio barile TIM, può essere importante per la stabilizzazione della struttura terziaria dell'enzima.[25]
Nella struttura cristallina, sembra che Arg216, un membro del dominio "jelly roll" della proteina, formi un ponte salino con Glu352. Pertanto, Glu352 è probabilmente coinvolta nello stabilizzare l'interazione tra due differenti domini tridimensionali dell'enzima.[1]

Applicazioni molecolari: uso come gene reporter modifica

In biologia molecolare, la β-glucuronidasi è utilizzata come gene reporter per monitorare l'espressione genica in cellule di mammiferi e vegetali. Il monitoraggio dell'attività della β-glucuronidasi attraverso l'uso di un saggio GUS permette di determinare l'espressione spaziale e temporale del gene in questione.[26] Immagini grafiche molecolari sono state prodotte utilizzando il pacchetto UCSF Chimera dal dipartimento risorse per Biocomputing, Visualizzazione e Informatica presso l'Università della California, San Francisco.

Note modifica

  1. ^ a b c S. Jain, WB. Drendel; ZW. Chen; FS. Mathews; WS. Sly; JH. Grubb, Structure of human beta-glucuronidase reveals candidate lysosomal targeting and active-site motifs., in Nat Struct Biol, vol. 3, n. 4, aprile 1996, pp. 375-81, PMID 8599764.
  2. ^ a b c Michael, ed. Sinnott, Comprehensive Biological Catalysis, vol. 1, Manchester, UK, Academic Press, 1998, pp. 119–138, ISBN 0-12-646864-8.
  3. ^ JD. McCarter, SG. Withers, Mechanisms of enzymatic glycoside hydrolysis, in Curr Opin Struct Biol, vol. 4, n. 6, Dic 1994, pp. 885-92, PMID 7712292.
  4. ^ Sinnott ML, Catalytic mechanisms of enymatic glycosyl transfer, in Chem Rev, vol. 90, 1990, pp. 1171–1202, DOI:10.1021/cr00105a006.
  5. ^ a b William L. Nyhan, Bruce Barshop, Pinar Ozand, Atlas of Metabolic Diseases, 2ª ed., London, UK, Hodder Arnold, 2005, pp. 501–503, 546–550, ISBN 0-340-80970-1.
  6. ^ JL. Van Lancker, PL. Lentz, Study on the site of biosynthesis of beta-glucuronidase and its appearance in lysosome in normal and hypoxic rats., in J Histochem Cytochem, vol. 18, n. 8, Ago 1970, pp. 529-41, PMID 5449980.
  7. ^ MR. Islam, JH. Grubb; WS. Sly, C-terminal processing of human beta-glucuronidase. The propeptide is required for full expression of catalytic activity, intracellular retention, and proper phosphorylation., in J Biol Chem, vol. 268, n. 30, Ott 1993, pp. 22627-33, PMID 8226771.
  8. ^ JM. Shipley, JH. Grubb; WS. Sly, The role of glycosylation and phosphorylation in the expression of active human beta-glucuronidase., in J Biol Chem, vol. 268, n. 16, Giu 1993, pp. 12193-8, PMID 8505339.
  9. ^ a b Kim HW, Mino K, Ishikawa K, Crystallization and preliminary X-ray analysis of endoglucanase from Pyrococcus horikoshii, in Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun., vol. 64, Pt 12, Dic 2008, pp. 1169–71, DOI:10.1107/S1744309108036919, PMC 2593689, PMID 19052378.
  10. ^ (EN) Michelle de Graaf, Epie Boven, Hans W. Scheeren, Hidde J. Haisma, Herbert M. Pinedo, Beta-Glucuronidase-Mediated Drug Release, in Current Pharmaceutical Design, vol. 8, n. 15, pp. 1391–1403, DOI:10.2174/1381612023394485.
    «The selective activation of a relatively non-toxic prodrug by an enzyme present only in the tumour should enhance the drug concentration at the tumour site and result in a better anti-tumour effect and a reduction in systemic toxicity as compared to conventional chemotherapy. β-Glucuronidase is such an enzyme. It is normally expressed in the lysosomes of cells. In larger tumours, however, high levels of the enzyme are present in necrotic areas. Several glucuronide prodrugs have been synthesised that can be activated by β- glucuronidase.»
  11. ^ (EN) David M Rubin e Ely J Rubin, A minimal toxicity approach to cancer therapy: Possible role of beta-glucuronidase, in Medical Hypotheses, vol. 6, n. 1, 1980-01, pp. 85–92, DOI:10.1016/0306-9877(80)90035-3.
    «Most cancer cells differ from normal cells in that they show higher beta-glucuronidase activity and lower pH of their cytoplasm. Anti-cancer drugs can be designed which take advantage of these gradients to deliver maximal toxicity to tumors and minimal toxicity to normal tissue.»
  12. ^ (EN) C. Vaquero, C. Masson e M. Guigon, Beta-glucuronidase in human cutaneous tumours, in European Journal of Cancer (1965), vol. 11, n. 10, 1975-10, pp. 739–IN6, DOI:10.1016/0014-2964(75)90049-3.
  13. ^ (EN) S. C. Kasdon, BETA-GLUCURONIDASE STUDIES IN WOMEN: 2. Cancer of the Cervix Uteri, in Journal of the American Medical Association, vol. 144, n. 11, 11 novembre 1950, pp. 892, DOI:10.1001/jama.1950.02920110004002.
  14. ^ (EN) Bernhard Grace M. Jeffree, C. H. G. Price, BONE TUMOURS AND THEIR ENZYMES - A Study of the Phosphatases, Non-specific Esterases and Beta-glucuronidase of Osteogenic and Cartilaginous Tumours, Fibroblastic and Giant-cell Lesions, The Bone and Joint Journal, Published 1 February 1965, su bjj.boneandjoint.org.uk. URL consultato il 23 marzo 2016 (archiviato dall'url originale il 7 aprile 2016). citato da 76
  15. ^ (EN) Bernhard Sperker, Janne T. Backman, Heyo K. Kroemer, The Role of β-Glucuronidase in Drug Disposition and Drug Targeting in Humans, Clinical Pharmacokinetics, July 1997, Volume 33, Issue 1, pp 18-31, First online: 25 October 2012, su link.springer.com.
  16. ^ (EN) Bernhard Sanjeev Jain1, 3, William B. Drendel, Zhi-wei Chen, F. Scott Mathews, William S. Sly & Jeffrey H. Grubb, Structure of human -glucuronidase reveals candidate lysosomal targeting and active-site motifs, su Nature Structural Biology 3, 375 - 381 (1996) doi:10.1038/nsb0496-375, su nature.com.
  17. ^ B. Henrissat, A. Bairoch, New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities., in Biochem J, 293 ( Pt 3), Ago 1993, pp. 781-8, PMID 8352747.
  18. ^ B. Henrissat, A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities., in Biochem J, 280 ( Pt 2), Dic 1991, pp. 309-16, PMID 1747104.
  19. ^ MR. Islam, S. Tomatsu; GN. Shah; JH. Grubb; S. Jain; WS. Sly, Active site residues of human beta-glucuronidase. Evidence for Glu(540) as the nucleophile and Glu(451) as the acid-base residue., in J Biol Chem, vol. 274, n. 33, Ago 1999, pp. 23451-5, PMID 10438523.
  20. ^ AW. Wong, S. He; JH. Grubb; WS. Sly; SG. Withers, Identification of Glu-540 as the catalytic nucleophile of human beta-glucuronidase using electrospray mass spectrometry., in J Biol Chem, vol. 273, n. 51, Dic 1998, pp. 34057-62, PMID 9852062.
  21. ^ EzCatDB: T00066, su EzCatDB: A Database of Catalytic Mechanisms. URL consultato il 2 febbraio 2014 (archiviato dall'url originale il 17 giugno 2009).
  22. ^ B. Henrissat, I. Callebaut; S. Fabrega; P. Lehn; JP. Mornon; G. Davies, Conserved catalytic machinery and the prediction of a common fold for several families of glycosyl hydrolases., in Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 92, n. 15, Lug 1995, pp. 7090-4, PMID 7624375.
  23. ^ EH. Birkenmeier, MT. Davisson; WG. Beamer; RE. Ganschow; CA. Vogler; B. Gwynn; KA. Lyford; LM. Maltais; CJ. Wawrzyniak, Murine mucopolysaccharidosis type VII. Characterization of a mouse with beta-glucuronidase deficiency., in J Clin Invest, vol. 83, n. 4, aprile 1989, pp. 1258-66, DOI:10.1172/JCI114010, PMID 2495302.
  24. ^ ME. Haskins, RJ. Desnick; N. DiFerrante; PF. Jezyk; DF. Patterson, Beta-glucuronidase deficiency in a dog: a model of human mucopolysaccharidosis VII., in Pediatr Res, vol. 18, n. 10, Ott 1984, pp. 980-4, PMID 6436780.
  25. ^ JC. Fyfe, RL. Kurzhals; ME. Lassaline; PS. Henthorn; PR. Alur; P. Wang; JH. Wolfe; U. Giger; ME. Haskins; DF. Patterson; H. Sun, Molecular basis of feline beta-glucuronidase deficiency: an animal model of mucopolysaccharidosis VII., in Genomics, vol. 58, n. 2, Giu 1999, pp. 121-8, DOI:10.1006/geno.1999.5825, PMID 10366443.
  26. ^ SV. Marathe, JE. McEwen, Vectors with the gus reporter gene for identifying and quantitating promoter regions in Saccharomyces cerevisiae., in Gene, vol. 154, n. 1, febbraio 1995, pp. 105-7, PMID 7867935.
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